Carbonato di calcio 208

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Stabile amorfo carbonato di calcio è il componente principale delle Strutture Calcio conservazione del cavimana carbonato di calcio amorfo Crostaceo Orchestia (ACC) è la forma meno stabile delle sei fasi note di carbonato di calcio. E ', tuttavia, prodotto e stabilizzata da una varietà di organismi. In questo studio abbiamo esaminato strutture di stoccaggio di calcio dalla terrestre crostaceo cavimana Orchestia, al fine di comprendere meglio la loro modalità di formazione e funzione. Utilizzando la diffrazione a raggi X, spettroscopia infrarossa e Raman, analisi termica e analisi elementare, abbiamo determinato che il minerale comprendente queste strutture di stoccaggio è carbonato di calcio amorfo, con piccole quantità di fosfato di calcio amorfo (5). Si suggerisce che l'uso del carbonato di calcio amorfo, può essere vantaggioso per queste strutture di stoccaggio, che funzionano come serbatoi di ioni durante il periodo animale muta. La sua elevata solubilità è benefico per la memorizzazione temporanea di ioni di carbonato di calcio che vengono successivamente dissolto e usati altrove. Stabilizzazione di questi minerali amorfi è probabilmente dovuto al costituenti macromolecolari della matrice organica, e al magnesio e fosfato presente nella fase minerale. minerali amorfi costituiscono poco meno di un quarto di tutti biominerali noti (1). Quando formata senza controllo biologico, questi minerali sono generalmente metastabile rispetto alle loro controparti cristallini. Essi tendono a trasformarsi in una forma cristallina più stabile. Al contrario, minerali amorfi biologicamente controllate sono, nella maggior parte dei casi, stabilizzata da organismi per tutta la loro vita. Ci sono alcuni esempi in cui biogene minerali amorfi sono utilizzati come precursori per fasi minerali cristallini (1), e due di questi implicano la formazione di una fase di carbonato di calcio amorfo transitorio (2, 3). Poiché minerali amorfi sono isotropici in luce polarizzata e non diffrangono i raggi X, la loro presenza in un tessuto biologico è stato spesso trascurato. E 'particolarmente difficile identificare e caratterizzare quando un minerale cristallino è presente. Biogene minerali amorfi possono quindi essere molto più comune di quanto attualmente è apprezzato. Qui identificare e caratterizzare la presenza di carbonato di calcio amorfo e fosfato di calcio amorfo (ACP) in uno dei sistemi biomineralizing più intensamente studiato. Poiché la maggior parte dei minerali amorfi sono instabili, tendono a dissolversi piuttosto facilmente. Questo può essere un vantaggio quando è richiesta la sostituzione frequente del minerale. La maggior parte dei crostacei hanno esoscheletri mineralizzate (o cuticole) che vengono ciclicamente rinnova con carbonato di calcio esogena o endogena. L'uso di una fase amorfa come il minerale comporre la cuticola, chiamato anche carapace, può quindi essere vantaggioso. Infatti, carbonato di calcio amorfo è stato rilevato in cuticole, e la sua presenza è associato con grandi quantità di fosfato (4, 5). Tuttavia, il minerale precipitato nella cuticola della maggior parte dei crostacei è calcite cristallina, con qualche vaterite anche segnalato (recensito in 1, 6, 7). rinnovo frequente dello scheletro richiede un serbatoio di ioni. Crostacei ottenere il calcio di cui hanno bisogno dal loro ambiente, e in aggiunta alcune specie hanno sviluppato strategie di archiviazione calcio (6, 8). La forma minerale in cui gli ioni di calcio vengono mantenute in queste strutture di stoccaggio è ancora enigmatico. Electron diffrazione strutture di stoccaggio di calcio elaborate, noto anche come piatti sternale, del terrestre crostacei scaber Porcellio dimostrato che non diffrangono e sono probabilmente composti da carbonato di calcio amorfo (9). In alcuni gamberi, gastroliti presentate essere composto da carbonato di calcio in uno stato estremamente poco cristallina, poiché non diffrangono i raggi X o elettroni (10). Il terrestre crostaceo Orchestia negozi cavimana calcio provenienti soprattutto dalla sua vecchia cuticola in diverticoli del midgut (11). Il calcio immagazzinato nelle concrezioni costituisce circa il 60 del contenuto di calcio cuticole il resto proviene dalla cuticola capannone (noto anche come exuviae) ingerito dall'animale appena dopo ecdysis, e dal cibo. Poiché la calcificazione di questo nuovo esoscheletro rappresenta, tra le altre cose, un mezzo di difesa contro pressioni ambientali, questo processo deve avvenire nel minor tempo possibile. Il calcio è conservato per circa 15 giorni nel periodo premolt (12). Dopo ecdysis, cioè il momento in cui l'animale lascia la vecchia cuticola, il calcio è riassorbito in meno di 48 h per mineralizzare rapidamente la nuova cuticola in un breve periodo postmolt (12, 13). L'esatto meccanismo di scioglimento non è noto. Abbiamo il sospetto che carbonica può essere coinvolto. L'attività dell'anidrasi carbonica è stata rilevata istochimicamente a livello apicale delle cellule epiteliali organi di stoccaggio (14). Questo enzima potrebbe essere responsabile per il rapido rilascio di una grande quantità di ioni calcio che possono entrare l'epitelio via Ca 2 -2H antiports o semplicemente lungo un gradiente di concentrazione (15). Il calcio passa poi attraverso le cellule epiteliali di un percorso paracellulare come sferule calcificate. Altre strutture mineralizzate transitorie sono prodotte in una rete di membrana intercellulare dilatato per precipitazione dei sali di calcio all'interno di una matrice organica sintetizzata dalle cellule stoccaggio organo. Essi vengono poi riassorbiti nella parte basale dell'epitelio, e Ca 2 rilasciato viene scaricato nel emolinfa attraverso la lamina basale (13, 15). Dopo completa dissoluzione delle concrezioni, la matrice organica viene rimosso dalla via midgut a cui sono collegati gli organi di stoccaggio, come indicato da studi di orchestin, un componente ben caratterizzato della matrice organica (16, 17). Le strutture di stoccaggio calcificati, chiamati concrezioni calcaree, sono composti da una matrice organica cui componenti proteici sono stati analizzati (16, 17). Le proteine ​​sono sintetizzate dalle cellule stoccaggio organo nel quale sono precipitati sali di calcio. spheruliths singoli vengono dapprima elaborati extracellulare nel lume degli organi tubolari di stoccaggio. L'integrazione di vari singoli spheruliths forme composto spheruliths circa 800 m di lunghezza e 400 m di diametro (Fig. 1) in un individuo adulto. Le concrezioni variano tra singoli spheruliths e spheruliths composto nel 8 mm di lunghezza organi di riserva per adulti. Questo facilita la flessibilità necessaria per questi animali salto (18). Le concrezioni sono state inizialmente considerate forme di escrezione. E 'ormai ben noto che queste strutture mineralizzate sono depositi di calcio transitori (18, 19). Scansione al microscopio elettronico di un spherulith composto di Orchestia cavimana elaborata durante il periodo premolt. crostacei anfipodi terrestri (Orchestia cavimana) sono stati allevati in laboratorio in terrari sott'acqua e messo in scena come descritto da Graf (12). concrezioni calcaree sono stati estratti dal cca posteriore (gli organi di stoccaggio appaiati) di animali appena prima o dopo ecdysis da microdissezione sotto una lente di ingrandimento binoculare. L'aspetto luminosa esterna e il aspetto traslucido delle concrezioni come osservato mediante microscopia ottica assicurato che erano completamente privi di materia organica circostante. Concrezioni sono stati conservati essiccato a 4 ° C fino al momento dell'uso. Un precedente esperimento di diffrazione di Debye-Scherrer radiografia eseguita da Graf (18) ha portato alla conclusione che le concrezioni in Orchestia sono probabilmente poco calcite cristallizzata. La natura della forma mineralogica dei depositi calcarei e le loro caratteristiche Permane tuttavia chiaro. Abbiamo quindi usato diffrazione di raggi X, analisi termogravimetrica, spettroscopia infrarossa e Raman, la microscopia elettronica a scansione e spettrometria a dispersione di energia per caratterizzare la componente minerale di queste concrezioni. osservazioni microscopio elettronico a scansione dei spheruliths che formano le concrezioni (Fig. 1) mostrano che essi possiedono una superficie molto liscia. Anche ad alto ingrandimento, nessun segno di struttura cristallina è evidente. Questa è stata la prima indicazione che queste concrezioni potrebbero essere costituiti da una fase amorfa. Abbiamo quindi ottenuto una polvere-analisi diffrattometrica delle concrezioni calcaree (Fig. 2). Il modello rivela un picco ampio, coerente con la presenza di una fase amorfa, accompagnato da picchi taglienti, che corrispondono a calcite. Era tuttavia evidente che le intensità delle riflessioni calcite sono molto deboli, e calcite non è quindi un componente importante. - Analisi diffrattometrica delle concrezioni calcaree Orchestia. I campioni sono stati macinati finemente e la polvere è stata sottoposta a un fascio di raggi X utilizzando la radiazione Cu K a 40 kV e 30 mA. Le misurazioni sono state effettuate con un passo di 0.029 e tempo di campionamento di 1,0 s / step utilizzando un diffrattometro attrezzata con un INEL CPS 120 localizzazione contatore curvo. L'aumento della linea di base è dovuto ad una fase amorfa, che i piccoli picchi aguzzi corrispondono calcite. Per comprendere ulteriormente mineralogia delle concrezioni, abbiamo effettuato IR e analisi spettroscopica Raman. Gli spettri IR dei concrezioni sia prima che dopo ecdysis sono identici e corrispondono al carbonato di calcio amorfo (Fig. 3a1 20). Quando abbiamo esaminato concrezioni utilizzando imaging microscopio Raman, a 9 su 12 analisi abbiamo ottenuto uno spettro compatibile con carbonato di calcio amorfo (Fig. 3b1 21). In questi spettri si nota anche il picco a circa 950 centimetri 1. che è dovuto alla presenza di fosfato di calcio amorfo (22). In 3 dei 12 analisi abbiamo ottenuto spettri che corrispondono al carbonato di calcio amorfo, con picchi aggiuntivi che vengono assegnati a cristallino calcite (280 centimetri 1 e 712 centimetri 1). È interessante notare che le intensità calcite picco sono abbastanza da non mascherare i amorfi picchi di carbonato di calcio debole. Questo indica anche che la parte cristallina del campione è piccola. Come non rilevare eventuali picchi di calcite nello spettro IR, possiamo concludere che la parte cristallina costituisce meno di circa 5 del campione complessivo. Il verificarsi di una certa cristallinità nelle misure Raman è coerente con i dati ottenuti dalle misurazioni di diffrazione di raggi X. Come calcite è presente in piccole quantità e non sempre presente nei campioni analizzati, si crede che sia un artefatto causato dalla procedura di estrazione, che comporta alcuni disidratazione del campione. Ciò potrebbe causare una parte della fase amorfa a cristallizzare. Travis (10) è giunto alla stessa conclusione. (A) spettri infrarossi di (a1) concrezioni dopo ecdysis, quando le strutture di stoccaggio vengono riassorbiti (spettro IR delle concrezioni prima ecdysis era identico e pertanto non è mostrato) e spicole corno (a2) di controllo del Pyura pachydermatina composto carbonato di calcio amorfo stabile (ACC) (20). Lo spettro ACC è caratterizzato da un ampio picco del carbonato di piegatura 866 centimetri 1 e una spaccatura nel tratto asimmetrica dello ione carbonato in 1420 e 1474 centimetri 1. Il picco aggiuntivo a intorno al 1070 centimetri 1 è assegnata principalmente fosfati. Un campione in polvere (circa 0,1 mg) è stato miscelato con circa 10 mg di KBr anidra. La miscela viene pressata in un pellet di 7 mm di diametro. L'analisi è stata effettuata con una risoluzione di 4 centimetri 1 con uno spettrometro Midac Corporation FTIR. (B) spettri Raman di (b1) un'analisi di una concrezione prima ecdysis, alla fine del periodo di conservazione e (b2) di controllo spicole corna di Pyura pachydermatina composto di carbonato di calcio amorfo stabile (21). Gli spettri sono caratterizzati da un ampio picco a 150,25 mila centimetri 1 e circa 1080 centimetri 1. Notare che sia il campione ed il controllo hanno un ulteriore picco a circa 950 centimetri 1. che corrisponde ACP. Il fosforo è stato anche rilevato nelle concrezioni di dispersione di energia spettrometria (EDS). Per spettroscopia Raman, i campioni sono stati posti su vetrini e sono stati osservati con un microscopio Leica con un ingrandimento di 50, con luce bianca riflessa. Dopo focalizzazione sull'oggetto, la sorgente luminosa del microscopio è stato trasferito a un diodo laser (780 nm). Gli spettri sono stati analizzati per 10 s nel range 1,0012 milioni centimetri 1. utilizzando un microscopio di imaging Renishaw Raman. Per EDS, i campioni sono stati incorporati in una miscela di Buehler ultra-montaggio polvere e liquido. Il campione era incorporato lucido, utilizzando un lucidatore Buehler Minimet, per ottenere una superficie del campione piana e montato su un mozzo di alluminio con nastro di carbonio biadesivo. La conducibilità è stata ulteriormente aumentata utilizzando pasta di carbonio conduttivo tra il campione incorporato e lo stub di alluminio, e il campione è stato carbonio rivestito per la microscopia elettronica a scansione (JSM-6400) e EDS (Oxford-ISIS). L'analisi è stata effettuata utilizzando SEMQuant con standard di ossido di magnesio per analisi di magnesio, wollastonite per l'analisi di calcio, e Gap per l'analisi fosforo. Abbiamo anche effettuato analisi termogravimetrica (TGA) in combinazione con il differenziale analisi termica (DTA) delle concrezioni prima e dopo ecdysis (Fig. 4). Le curve mostrano perdita di acqua di circa 15 (w / w), che è simile ad altri campioni biogeniche di carbonato di calcio amorfo (23), e circa il 30 perdita di peso a circa 780C, che corrisponde alla decomposizione del carbonato di calcio in ossido di calcio (24). Termogravimetrica (TGA / DTA) analisi delle concrezioni. Variazioni di (a) differenziale termogravimetria (DTG, / min) (b) termogravimetria (TG, mg) e termogravimetria (c) (TG,), in funzione della temperatura (C). Dopo l'estrazione, concrezioni calcaree stati rapidamente risciacquati in etanolo assoluto e essiccato all'aria. Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una Termobilancia SETARAM TG-DTA92 con un aumento della temperatura di 3C / min sotto aria compressa. Curve b) mostra la perdita di peso del campione all'aumentare della temperatura. Curve c) corrisponde alla stessa perdita di peso, ma espresso come percentuale del peso iniziale del campione. Curve a) corrisponde alla percentuale di perdita di peso con il tempo durante l'aumento della temperatura. Notiamo tre varianti principali: due piccoli (15) corrispondente alla perdita di acqua e materia organica a circa 100 e 200C ed uno più importante (30) corrispondente alla trasformazione del carbonato di calcio in ossido di calcio. Un prima microanalisi a raggi X rilevata la presenza di fosforo nelle concrezioni calcaree di Orchestia (15). Per determinare la composizione elementare di concrezioni, abbiamo eseguito energia spettrometria dispersiva (EDS per metodi vedi legenda Fig. 3). La composizione elementare di concrezioni è risultata essere piuttosto uniforme. In aggiunta agli elementi previsti (calcio e ossigeno), le concrezioni contengono 36 fosforo. Il fosforo è più probabile in forma di fosfato inorganico, che è probabilmente una componente del fosfato di calcio amorfo (come visto nel Raman e IR). Tuttavia non possiamo escludere la possibilità che alcuni di fosforo corrisponde a gruppi fosfato legati ai componenti proteici della matrice organica. Anzi, abbiamo la prova per una tale proteina fosforilata, orchestin (unpubl. Risultati). Piccole quantità di magnesio (1) sono state rilevate anche nelle analisi elementari di concrezioni. Concludiamo che le concrezioni da Orchestia cavimana sono composti stabili carbonato di calcio amorfo insieme a circa 5 fosfato di calcio amorfo. La presenza di fosfato associata con il carbonato di calcio amorfo diffusa (5). Qui mostriamo che in Orchestia, almeno parte di questa fosfato è associata con una fase fosfato di calcio amorfo separata. Il vantaggio della fase amorfa è probabilmente la sua relativamente elevata solubilità, in modo che possa essere facilmente sciolto e trasportato alla cuticola neoformato. È interessante notare che la fase amorfa del concrezione è stabile e non cambia durante la vita dell'animale in una forma cristallina più stabile. carbonato di calcio amorfo, che si forma in vitro in una soluzione sovrasatura, di solito è metastabile e trasforma rapidamente in una fase stabile cristallina (25). Quando fasi amorfe sono stabilizzate da organismi, componenti della matrice organica, come macromolecole (1. 20, 26) o ioni come fosfato o magnesio (21, 26 29), si pensa siano coinvolti in questa stabilizzazione. Sia magnesio e fosfato sono noti per inibire la crescita di cristalli, aumentando così i livelli di sovrasaturazione e consentendo la formazione di fasi metastabili come carbonato di calcio amorfo. Diverse proteine ​​estratte dalla cuticola del granchio blu illustrano l'importanza di macromolecole a sistemi simili. Queste proteine ​​hanno dimostrato di inibire nucleazione del carbonato di calcio fino a circa 1 h dopo ecdysis, quando sono sottoposti a determinate modifiche per consentire la precipitazione del minerale (30). È interessante notare, le macromolecole dalle concrezioni Orchestia non siano trasportati insieme con gli ioni di calcio e carbonato alla cuticola, ma sono conservati in prossimità delle concrezioni. Comprendere la funzione di mineralizzazione delle proteine ​​della matrice ben caratterizzati, come matrice gastrolith proteine ​​(GAMP) da gastroliti gamberi (31) o orchestin dalle concrezioni calcaree di Orchestia (17) potrebbe contribuire ad una migliore comprensione di come il carbonato di calcio amorfo nelle concrezioni forme e stabilizzata. Noi mostriamo che il carbonato di calcio amorfo è il componente principale delle strutture di crostacei terrestre stoccaggio, con fosfato di calcio amorfo, come componente minore. Identificazione e caratterizzazione della fase minerale è essenziale per la comprensione dei processi di biomineralization delle strutture di Orchestia stoccaggio. Queste osservazioni supportano l'idea che il carbonato di calcio amorfo è una fase importante in biomineralization, e chiarire come si è formato e stabilizzato può avere implicazioni più ampie per i materiali e la scienza medica. Ringraziamenti Gli autori sono fortemente in debito con Marie Mesnier e Denis Chaumont dal Laboratoire de Ractivit des Solides, Universit de Dijon, in Francia, per l'assistenza abile a diffrazione di raggi X e gli esperimenti TG. Ringraziamo anche il Prof. Lia Addadi per il suo consiglio. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione Stati Uniti-Israele binazionale Science Foundation e dalla Fondazione Minerva. Le note